HPLC optimal einsetzen. Группа авторов

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möglichst viel analytischer Information und möglichst kurzer Analysenzeit, oder anders ausgedrückt: so viel analytische Information wie nötig in so kurzer Analysenzeit wie möglich. Schnelle Trennungen gehen dabei mit einem gewissen Verlust an analytischer Information in Form von Auflösung einher. Leicht einsichtig wird dies, wenn man sich die Peakkapazität – bei Gradienttrennungen definiert als der Quotient aus der Gradientzeit und der durchschnittlichen Peakbasispeakbreite – relativ zum Gradientvolumen [3] als Produkt aus Gradientdauer und Flussrate betrachtet.

      Abbildung 3.1 veranschaulicht anhand eines UHPLC-Anwendungsbeispiels, wie sich die Peakkapazität in Abhängigkeit des Gradientvolumens, hier der einfacheren Übertragbarkeit wegen ausgedrückt als das Vielfache des Säulenvolumens, ändert. Es ergibt sich, dass die Peakkapazität einer Gradienttrennung mit steigendem Gradientvolumen zunächst steil ansteigt und dann einer Sättigung entgegenstrebt. Gemäß dem sich daraus ableitenden Gradientvolumenkonzept sind schnelle Trennungen, die durch kleine Gradientvolumina auf kleinlumigen und kurzen Säulen erreicht werden, damit begrenzt in ihrer Trennleistung und eignen sich daher bevorzugt für Screening-Experimente. Zusätzlichen Nutzen bietet hier das Massenspektrometer als weitere Trenndimension, indem es auch potenziell koeluierende Substanzen noch hinreichend voneinander getrennt zu detektieren und – mit gewissen Einschränkungen – zu quantifizieren vermag. Eine vollständige Basislinientrennung ist somit bei der MS-Detektion je nach verwendetem Massenspektrometer zur Quantifizierung nicht so unbedingt erforderlich wie in der konventionellen HPLC. Möglichst hohe Peakkapazitäten erfordern größere Gradientvolumina, längere Säulen und damit längere Laufzeiten.

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      Abb. 3.1 Peakkapazität in Abhängigkeit des Gradientvolumens, ausgedrückt als Vielfaches des Trennsäulenvolumens, gemessen für eine 250 × 2,1 mm-Säule mit einer Packungsteilchengröße von dp = 2,2 μm bei F = 670 μL/min.

      Empfehlungen

       • Hochauflösende Screening-Analysen können mit schnellen/steilen Gradienten und geringer Peakkapazität zu schnell für die Zykluszeit eines Massenspektrometers sein.

       • Gegebenenfalls muss auf Trenneffizienz verzichtet und die Auflösung künstlich vergrößert werden, um eine adäquate MS-Detektion zu erlauben.

       • Die durchschnittliche Cycle Time des Massenspektrometers unter den benötigten Detektionsbedingungen sollte für eine Quantifizierung mindestens 15, jedoch nicht weniger als 8–10 Datenpunkte pro Peak ermöglichen.

      Die leichte Flüchtigkeit muss genauso für alle Zusätze zur mobilen Phase gegeben sein. Sämtliche Additive, die schwerflüchtige Salze bilden, führen zu verstärkter Unterdrückung der Ionenbildung in der Quelle (Ionensuppression) und zu starker Verschmutzung der MS-Quelle mit Salzablagerungen. Dies erfordert eine häufige und intensive Reinigung der Ionenquelle und führt trotz diverser Konstruktionsverbesserungen durch die MS-Hersteller rasch zu einer spürbaren Abnahme in der Empfindlichkeit der Detektion. Zur pH-Einstellung und Pufferung sowie zur Verbesserung der Chromatographie sind daher HPLC-Klassiker wie Phosphate, Borate sowie alkali- und erdalkaliionenhaltige Salze zu vermeiden. Stattdessen bieten sich leichtflüchtige organische Säuren, Basen sowie deren Salze an. Saure pH-Werte werden bevorzugt mittels Ameisensäure, Essigsäure oder Trifluoressigsäure erzeugt, meist in Konzentrationen zwischen 0,05 und 0,1 vol.-%. Als Basen haben sich wässrige Ammoniaklösungen oder Alkylamine wie Triethylamin bewährt. Zur Pufferung empfehlen sich Ammoniumsalze wie Ammoniumformiat, -acetat oder -carbonat. Auch auf die Verwendung oxidativer Zusätze sollte verzichtet werden: Chloride als Eluentenzusatz führen z. B. nicht nur zu Ionensuppression, sie können auch unter dem Einfluss des Elektrosprays oxidativ wirkendes Chlor bilden und damit die Analyten chemisch verändern [5] sowie über die Zeit hinweg Bauteile wie die Spraykapillare korrodieren. Der Einsatz von leichtflüchtigen ionischen Detergenzien wird ebenfalls nicht empfohlen, da sich diese beim Eintreten in das Massenspektrometer auf den Oberflächen der Ionenoptik und des Massenanalysators ablagern und mittelfristig eine Funktionsstörung des Gerätes auslösen können. Es sei hier bereits angemerkt, dass die MS-gängigen Additive wegen ihrer physikochemischen Eigenschaften, die sich teilweise deutlich von den herkömmlichen LC-Modifiern unterscheiden, oft zu anderen Selektivitäten führen, als man sie von der klassischen HPLC her gewohnt sein mag (s. Abschn. 3.3.1). Dies gilt vor allem, wenn sie sekundäre selektivitätssteuernde Eigenschaften beeinflussen, wie beispielsweise die Ionenstärke oder die Tendenz zur Ionenpaarbildung bei polar retardierten Substanzen.

      Neben der Art des Eluentenadditivs spielt auch dessen Konzentration eine Rolle. LC-Methoden profitieren meist von einer möglichst hohen Additivkonzentration, so z. B. bei Pufferkapazitäten oder der Unterdrückung von elektrostatischen Wechselwirkungen des Analyten mit der stationären Phase. Die damit einhergehende hohe Leitfähigkeit führt allerdings zu hohen Stromflüssen in der Ionenquelle während des Ionisationsprozesses und damit oft zu technischen Problemen oder einer Instabilität des Sprays. In der Praxis empfiehlt es sich, Additive nicht konzentrierter als 25–30 mmol/l hinzuzufügen und möglichst auf mehrfach geladene Additivionen zu verzichten.

       • „MS-freundliches“ Phasensystem einsetzen und LC-Methode mit UV-Detektion optimieren

       • Stationäre Phasen mit geringem Säulenbluten verwenden

       • Flüchtige Eluentensysteme verwenden, meist zusammengesetzt aus flüchtigen


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