Цитология. Н. С. Стволинская
над клетками, находящимися в S-фазе клеточного цикла, появляются черные гранулы восстановленного серебра, образующиеся в фотоэмульсии.
Именно так в 60-е гг. XX в. было показано, что в составе нейронов головного мозга, в некоторых его отделах, возможна репликация ДНК. Но в то время было трудно представить, что в головном мозге млекопитающих присутствуют стволовые клетки, способные к делению. Тогда предположили, что репликация ДНК в нейронах головного мозга связана с процессом памяти.
Именно методом авторадиографии было показано, что ДНК всегда находится в ядре и никуда оттуда не выходит. РНК, напротив, синтезируется в ядре, а затем выходит в цитоплазму. Белок никогда не синтезируется в ядре. Место синтеза белка – рибосомы цитоплазмы. Отсюда белок может перемещаться и в ядро, и внутрь органелл цитоплазмы.
В заключение следует отметить, что каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. Исследователь должен использовать несколько взаимодополняющих методов, чтобы сделать окончательный вывод.
Вопросы
1. Для чего используется метод авторадиографии?
2. В чем суть метода?
3. Какие результаты получены с помощью этого метода?
Фракционирование клеток
С середины XX в. цитологи получили возможность исследовать не только целые клетки, но и отдельные органоиды, выделенные из клеток в жизнеспособном состоянии. Для этого используется метод фракционирования клеток, основанный на дифференциальном центрифугировании.
Для получения образцов органоидов фрагменты ткани разрушают таким образом, чтобы клеточные структуры остались неповрежденными. С этой целью подбирают подходящие условия гомогенизации, т. е. разрушения клеток, подходящую среду для выделения клеточных структур, буфер для поддержания определенного рН, в процессе выделения поддерживают низкую температуру, близкую к нулю. В результате получают суспензию клеточных органоидов, которая содержит ядра, митохондрии, лизосомы, аппарат Гольджи, фрагменты эндоплазматического ретикулума, рибосомы и обрывки клеточных мембран. Суспензию начинают центрифугировать на специальных приборах – центрифугах. Разные органоиды осаждаются на дно пробирки при разных скоростях центрифугирования. Скорость оседания зависит от размера частицы и ее плотности. При низких скоростях центрифугирования в первую очередь осаждаются ядра. Получив осадок ядер, оставшуюся суспензию переливают в другую пробирку для следующего этапа центрифугирования. Осадок, состоящий из клеточных ядер, размешивают и используют в экспериментальной работе. Так повторяют несколько раз, увеличивая скорость и продолжительность центрифугирования. Самые высокие скорости центрифугирования необходимы для получения самых маленьких органелл – рибосом. Ядра осаждаются на дно пробирки при центрифугировании в течение двух минут с ускорением 2000 g. Осадок митохондрий получают через 30 минут центрифугирования с ускорением 15 000 g, а рибосомы собирают через 3 часа центрифугирования