Temas selectos en ecología química de insectos. Julio C. Rojas
Perkin Elmer, Carlo Erba, Tekmar). Una de las aplicaciones de esta técnica fue en el análisis de atrayentes de fruta fermentada o madura (Cossé et al., 1995). Posteriormente, Drijfhout et al. (2000) reportaron la aplicación de la desadsorción térmica en el análisis de la feromona sexual de Adoxophyes orana (Lepidoptera: Tortricidae) and Campylomma verbasci (Heteroptera: Miridae) a partir de un solo insecto mediante esta técnica.
Métodos de muestreos de compuestos volátiles de manera estática
Esta técnica permite lograr un equilibrio entre la muestra y su espacio aéreo y entonces un volumen de la muestra es inyectada directamente al cromatógrafo de gases para su análisis. La cantidad de analito transferido al instrumento es proporcional al volumen de la fase gaseosa y a la concentración del analito (Pawliszyn, 1997).
Figura 2. Técnica de captura de volátiles por desorción térmica (TDS). 1. Sistema de desorción térmica; 2. Parte de horno de TDS; 3. Tubo TDS; 4. Flujo de gas (hidrógeno); 5. Línea de transferencia, (300 °C); 6. Inyector PTv; 7. FID; 8. GC (tomada de Drijfhout et al. 2000).
Muestreo del espacio aéreo con una jeringa. la manera más simple de la técnica consiste en el muestreo directo de volátiles del espacio aéreo de una muestra equilibrada en un recipiente cerrado. Una alícuota (100-1000 µL) de los gases del espacio aéreo es removida con una jeringa e inyectada directamente al equipo. Este método es recomendado solamente con compuestos cuyas concentraciones y presión de vapor son altas para proveer al menos cantidades de nanogramos en la alícuota (Millar & Sims, 1998).
Microextraccion en fase sólida (MEFS). Es una técnica simple y efectiva de adsorción-desadsorción que no requiere de disolvente y fue desarrollada en la Universidad de Waterloo en Ontario, Canadá (Arthur et al., 1992). La MEFS consiste de una jeringa de gases modificada, conteniendo una fibra de sílica fundida de 1 cm, cubierta con un determinado polímero (Figura 3) (véase página de Sigma-Aldrich para mayor información sobre la elección de la fibra), el cual está adherido a una pequeña barra de acero inoxidable e instalado en el émbolo de una jeringa de gases. La fibra de la jeringa es previamente acondicionada a 150 ºC, haciéndole pasar un flujo de nitrógeno. Posteriormente es introducida a través de un septo en el recipiente que contiene la muestra para capturar los volátiles durante un periodo de tiempo que puede variar dependiendo de varios factores tales como el tipo de fibra, la concentración de los volátiles y la temperatura de muestreo, entre otros (Pawliszyn, 1997). Después del muestreo, la fibra es colocada directamente en el inyector del cromatógrafo, en donde los compuestos volátiles son desadsorbidos térmicamente y transportados por el gas de arrastre hacia la columna. La fibra, previamente limpiada, puede ser re-utilizada hasta 100 veces, aproximadamente. Esta técnica ha sido utilizada con buenos resultados en la identificación de la feromona de Metamasius hemipterus (Malosse et al., 1995) y Phyllonorycter sylvella (Borg-Karlson & Mozuraitis, 1996), y de volátiles de plantas (Tholl et al., 2006). Recientemente se han hecho modificaciones a esta técnica, encontrándose que un lápiz hecho en casa con fibra de plomo extrajo hasta 1000 veces más volátiles de insectos que la fibra comercial de polidimetilsiloxano (PDMS) (Djozan et al., 2005).
Figura 3. Jeringa y fibra adsorbente para la colecta de volátiles por micro extracción en fase sólida (SPME) (Tomada de Supelco).
Extracción por adsorción en barra agitadora. Esta técnica surgió debido a las limitaciones que presenta la MEFS con respecto a su baja eficiencia de extracción. La fase de extracción usada en este método es la misma que se usa en la MEFS, PDMS, pero las barras son recubiertas con 50 a 250 veces más cantidades del polímero. Por ejemplo, una barra de 10 mm tiene 5 µL de PDMS y una de 40 mm tiene 219 µL del polímetro, mientras que una fibra de MESF tiene menos de 0.5 µL de PDMS. Después de un cierto tiempo de exposición, la barra agitadora es removida, introducida a un tubo de vidrio y transferida a un instrumento de desadsorción térmica donde los compuestos son liberados térmicamente y transferidos al equipo (Baltussen et al., 1999). Adicionalmente, los compuestos también pueden ser desadsorbidos usando un disolvente. Debido a la fase usada, esta técnica sólo extrae compuestos no polares y pocos polares. Los compuestos polares pueden ser extraídos después de derivatizarlos mediante reactivos específicos y analizados posteriormente. Hasta ahora existen pocos ejemplos de este método de extracción de volátiles de insectos y plantas (Scascighini et al., 2005), ya que básicamente se ha usado para la extracción y concentración de compuestos de matrices líquidas, pero podría ser más usado en el futuro debido a su mayor sensibilidad en comparación con la MEFS. Recientemente, un grupo de investigadores aislaron compuestos de agua de criaderos de mosquitos usando este método de extracción, estos compuestos atraen a las hembras de los mosquitos a los sitios de oviposición (Carson et al., 2010). Una versión comercial de este sistema con el nombre de “Twister” puede ser adquirida de la compañía Gerstel, Alemania, que tiene distribuidores en varios países de América Latina.
Muestreo de volátiles de modo pasivo/difuso
Esta tecnología fue desarrollada para monitorear la calidad del aire, pero un trabajo reciente ha mostrado que puede ser usada para muestrear los volátiles de árboles de manzana en el campo (Vallat et al., 2005), por lo que podría tener aplicaciones en el área de la ecología química en un futuro cercano. El muestreo pasivo depende de la difusión molecular de los analitos a través de una superficie difusa sobre un adsorbente. Este sistema no necesita de electricidad, es simple de usar y es relativamente barato. Después del muestreo, los analitos adsorbidos pueden ser desadorbidos con un disolvente o con calor. Una versión comercial de este muestreador de volátiles, conocido como Radiello, puede ser conseguida a través de Supelco.
Evaluación comportamental
Aparatos para medir la respuesta de insectos a semioquímicos en el laboratorio
Cualquier aparato usado para determinar la respuesta cualitativa o cuantitativa de un insecto a un determinado olor es conocido generalmente como una arena, un olfatómetro o un túnel de vuelo. La primera pregunta a la que se enfrenta un estudiante o investigador que desea evaluar la actividad biológica de un extracto o un compuesto sintético es ¿qué tipo de aparato debo usar? Indudablemente la elección o diseño del aparato es de crucial importancia para la determinación de la actividad biológica, y la decisión deberá ser tomada considerando varios factores, entre los que destaca el comportamiento del insecto que se desea evaluar, el tamaño del insecto, si vuela o no, si es de hábitos nocturnos o diurnos, etc.
Cualquiera que sea su diseño, un aparato debe cumplir con los siguientes requerimientos: 1) la evaluación de las muestras debe ser simple y rápida en un tiempo limitado; 2) fácil observación de los actos comportamentales a estudiar, por ejemplo, vuelo al azar, vuelo dirigido, aterrizaje; y 3) fácil control y prevención de la contaminación causada por un estimulo previo (Schreck et al., 1981). Tradicionalmente, los aparatos han sido clasificados en dos grandes grupos, los que no usan aire y aquellos que usan aire para transportar a las moléculas odoríferas (Baker & Linn, 1984; Baker & Cardé, 1984). Antes de intentar copiar cualquier aparato es aconsejable revisar cuidadosamente la información que ha sido obtenida usando dicha arena, olfatómetro o túnel de vuelo, para ver si se adapta a nuestras necesidades (Finch, 1986).
Olfatómetros sin aire
Existen una gran variedad de diseños, pero fundamentalmente en estos olfatómetros, los insectos encuentran a la fuente de olor a una corta distancia o al contacto, debido a que los compuestos volátiles son dispersados por simple difusión. El diseño más simple de este tipo de olfatómetro es una caja Petri, pero existen otros modelos más complejos. Básicamente se han usado para insectos caminadores (o poco voladores) y generalmente sólo se puede medir la respuesta de atracción o repelencia, aunque en el caso de hormigas y larvas de Lepidoptera fue usado para evaluar el seguimiento de una feromona de ruta. La mayor ventaja de estos olfatómetros es que su construcción es muy simple. Las