Temas selectos en ecología química de insectos. Julio C. Rojas
algunas ocasiones la técnica CG-EAD no permite ver la respuesta antenal a los compuestos de un determinado extracto debido a que existen pocos receptores en la antena del insecto y entonces la CG-RUC se convierte en un suplemento de la CGEAD. El primer acoplamiento de CG y RuC fue logrado independientemente por Wadhams (1982) trabajando con el descortezador Scolytus scolytus, y por Van Der Pers & Lofstedt (1983) trabajando con la palomilla Agrotis segetum. En esta técnica el efluente de la columna del CG es detectado simultáneamente por el DIF del CG y la neurona olfativa del insecto. El uso de CG-RUC ha permitido determinar los receptores de la feromona y volátiles de hospedera y de no-hospedera (Tømmerás & Mustaparta, 1987; Wibe et al., 1997; Bichao et al., 2005). Por ejemplo, en el escarabajo descortezador Ips typographus, la respuesta a los olores de la corteza fue estudiada por CG acoplada a registros electrofisiológicos de células receptoras olfativas, y se encontraron cuatro fracciones menores pertenecientes a dos extractos que excitaban células receptoras olfativas. La respuesta de las células fue dividida en dos grupos principales reaccionando exclusivamente a una fracción, sugiriendo que las células fueron altamente especializadas a un olor de la hospedera particular. Sin embargo, un extracto efectivo o fracción no pudo ser encontrada para la mitad de las unidades olfatorias respondiendo a la corteza natural, sugiriendo que posiblemente los compuestos activos relevantes fueron perdidos durante la extracción y/o CG (Tømmerás & Mustaparta, 1987). En este mismo sentido, Bichao et al. (2005) estudiaron las neuronas receptoras de la antena del picudo Anthonomus rubi a compuestos producidos por la planta de fresa usando CG acoplada a registro unicelular. Reportaron la presencia de cinco tipos de neuronas receptoras olfativas, identificadas de acuerdo con un olor primario, por ejemplo, el compuesto al cual las neuronas son más sensitivas. Los compuestos identificados fueron (-)-germacrene d, (-)-ß-cariofileno, salicilato de metilo, (E)-ß-ocimeno y (3E)-4,8-dimethil-1,3,7-nonatrieno, que están presentes en la planta de fresa, y fueron producidos en grandes cantidades cuando los picudos estaban alimentándose.
Identificación química
Cromatografía de gases
La CG es una de las técnicas más utilizadas en el análisis de compuestos volátiles con una fuerte aplicación en la industria petroquímica, farmacéutica, plástico, pinturas, agroquímicos y de alimentos, entre otras. El uso de la CG en la separación y aislamiento de semioquímicos de insectos se remota a los años 60. Las ventajas de la CG para el análisis de compuestos volátiles y semivolátiles son: 1) tiene alta resolución, ya que más de 100 compuestos pueden ser separados en una sola corrida; 2) la CG es simple, rápida, flexible, robusta, y relativamente es un método barato que puede ser usado rutinariamente con un mínimo de entrenamiento; 3) el detector DIF, es bastante sensitivo (10-100 picogramos) y universal, permitiendo la detección de todos los compuestos de una extracto; 4) los índices de retención (tiempo de retención relativos) son reproducibles entre diferentes instrumentos y laboratorios, constituyéndose en una valiosa herramienta para la identificación de compuestos; y 5) un equipo de CG puede trabajar por décadas (Heath & dueben, 1998).
Los componentes básicos de la CG son: un cilindro conteniendo el gas de arrastre y su regulador de flujo. El horno que es donde se encuentra la columna, considerada el corazón del equipo, ya que en la columna es donde ocurre la separación de los componentes de la muestra. En un extremo la columna se conecta al inyector, que es una pequeña cámara que permite la entrada de la muestra a la columna. El otro extremo de la columna se conecta al detector, que es un sistema que convierte la señal química obtenida en el análisis en señal eléctrica. Esta señal eléctrica puede ser plasmada en un registrador o en un integrador. Los equipos modernos incorporan una computadora desde la cual se controla el funcionamiento del aparato, análisis, y edición y se imprime o se guarda la información del análisis.
El gas de arrastre funciona como fase móvil y contribuye al desplazamiento de los componentes de la muestra a través de la columna hacia el detector. La selección del gas de arrastre es un punto importante ya que no deberá ser reactivo, no-tóxico, no-flamable, y en la medida de lo posible no debe ser caro. Los gases más comúnmente utilizados son hidrógeno, helio y nitrógeno. El nitrógeno a flujo lento, permite obtener una buena eficiencia cromatográfica. Sin embargo, la eficiencia del nitrógeno decrece cuando se incrementa o disminuye el flujo, y esto origina prolongados tiempos de permanencia en el inyector y en la columna, con la posibilidad de causar degradación térmica a algún componente de la muestra. Estos factores contribuyen a que el nitrógeno sea calificado como no apropiado como gas acarreador, a pesar de su bajo costo. El hidrógeno no es caro y tiene excelentes propiedades cromatográficas, sin embargo, la mayor desventaja es su alta flamabilidad, haciendo indispensable que el flujo del “split” y de purga sean expulsados hacia fuera del laboratorio. El helio representa una buena opción, ya que aunque es más caro que los otros gases, no es explosivo y proporciona una buena resolución cromatográfica. Debido a que el helio es completamente inerte, no hay posibilidad de reacción con el analito.
El inyector es una pequeña cámara en donde se volatiliza la muestra líquida disuelta en un disolvente para ser arrastrada hacia la columna. Existen varios tipos de inyectores: “on-column”, “split”, “splitless”, y cada uno tiene sus ventajas y desventajas. En el caso de muestras de estudios de semioquímicos, por lo general se utiliza el inyector en “splitless”, ya que éste permite la entrada de la muestra en su totalidad, a diferencia del inyector en “split” que sólo permite la entrada de la muestra en un porcentaje determinado dependiendo del flujo de venteo con el que se esté trabajando.
Uno de los componentes principales de la CG es la columna y es considerado el corazón del proceso del GC debido a que en la columna ocurre la separación de los componentes presentes en una muestra inyectada. Las columnas capilares comerciales normalmente son tubos de sílica fundida cubiertos externamente con poliamida, conteniendo por dentro la capa de la fase estacionaria. Las columnas empacadas están hechas de vidrio o de metal y por lo general son de 1-3 m de longitud por 2-6 mm diámetro interno. Sin embargo, el uso de este tipo de columnas en ecología química es limitado debido a la baja resolución comparado contra las columnas capilares. Las columnas capilares de 20-30 m largo por 0.25-0.32 mm de diámetro interno son las más comunes para trabajar en CG con buena resolución y tiempos razonables de análisis. Columnas de menor longitud reducen la eficiencia pero pueden ser muy útiles para hacer un análisis preliminar. Por el contrario, columnas de 100 m de largo han sido usadas en aquellos casos en donde se requiere una alta resolución o en el análisis de mezclas complejas. Columnas de más 100 m de largo no son prácticas ya que se eleva mucho la presión dentro de la columna, además de que los tiempos de retención son muy grandes, disminuyendo la eficiencia de la columna. La selección de la fase estacionaria de la columna adecuada depende de las propiedades físicas y químicas del analito a ser separado. Hay dos factores por considerar, primeramente la volatilidad de los compuestos que determinará en términos generales los parámetros como temperatura, grosor de la fase estacionaria requerida para el análisis. En segundo lugar hay que considerar la interacción de los analitos con la fase estacionaria que determinará la separación de los compuestos con volatilidad similar. En este sentido, se sugiere que los compuestos polares pueden resolverse mejor en columnas conteniendo fase estacionaria intermedia o polares. En algunas ocasiones cuando se analizan muestras nuevas que contienen compuestos similares como isómeros se sugiere que el análisis de las muestras se realice en al menos dos columnas diferentes para minimizar la posibilidad de elusión coincidente. Sin embargo, hay casos en donde los compuestos coeluyen y la separación puede ser un problema, como en isómeros E y Z, y en isómeros de cadena larga con la presencia de doble enlace. En este caso, para separar isómeros E de Z se sugiere utilizar una columna de 50-60 m de largo. Los compuestos monoinsaturados pueden ser pobremente resueltos o separados de sus respectivos análogos saturados en columnas conteniendo fase estacionaria no polar, aunque estos compuestos pueden ser separados fácilmente en columnas con fase polar. En términos generales, las columnas con fase no polar tienen ventaja sobre las columnas con fase polar. Hay varias compañías que venden columnas capilares con diferentes fases para ser utilizadas en CG en el análisis de compuestos. Para la selección de la columna, hay que tomar en cuenta los siguientes puntos. Primero, que cada fase estacionaria tiene un máximo y un