Temas selectos en ecología química de insectos. Julio C. Rojas

      Figura 5. Esquema de la técnica electroantenografia (EAG) (Tomada de Syntech).

      Registro unicelular

      Los primeros registros de células sensoriales fueron obtenidos del sensulo tricoideo de las antenas de escarabajos y palomillas (Schneider et al., 1964). Posteriormente, se reportó la técnica de registro extracelular que consiste en conectar el electrodo de registro a la punta del sénsulo y el electrodo indiferente a la base de la antena (Kaissling, 1974). Esta técnica permite medir la actividad y la excitación o inhibición de una neurona olfativa a un compuesto. Cuando varias neuronas olfativas están localizadas en un mismo sénsulo, pueden ser discriminadas por su potencial de acción (espiga), forma y amplitud. La técnica de registro unicelular es más complicada que la técnica de EAG. Actualmente el equipo para hacer registros unicelulares puede ser adquirido de Syntech, y usa un sistema de adquisición de datos inteligentes (IDAC-4) similar al descrito para el equipo de EAG, sólo que la señal emitida por la neurona olfativa es amplificada × 1000 veces. El convertidor A/D y los circuitos de control para el IDAC-4 están contenidos en una caja de 19 pulgadas, la cual es conectada a la computadora vía un cable USB. Además, por lo general el equipo cuenta con un par de bocinas para escuchar el sonido de las señales (espigas eléctricas) emitidas por las células receptoras cuando son estimuladas. Esta respuesta es comparada con el número de señales emitidas por el sénsulo al ser estimulada por aire. Los resultados de registros de células sensoriales se pueden mostrar de dos formas, una de manera directa enseñando el gráfico obtenido ante cada estímulo y comparado contra el del aire. La segunda opción es tomando en cuenta que en esta técnica, generalmente el tiempo de estimulación es de 20 segundos, y con la ayuda de un software especializado se puede determinar el número de espigas emitidas por sénsulo por segundo para un estímulo determinado y compararlo contra el número emitido al aire. Las células sensoriales son conectadas por medio de microelectrodos de tungsteno o usando microelectrodos de vidrio llenos con una solución salina. La composición de la solución salina parece ser más importante en los registros de unicelulares que en los de EAG. La principal ventaja de los microelectrodos de tungsteno es que las conexiones son fácilmente logradas con sénsulos que están densamente empaquetados o son muy pequeños, mientras que la principal ventaja de los microelectrodos de vidrio es que se pueden lograr registros de bajo ruido debido a la baja impedancia eléctrica creada entre la hemolinfa y la solución salina (Bjostad, 1998).

      Cromatografía de gases acoplada a un electroantenodetector (CG-EAD)

      Un avance notable en la identificación de feromonas y atrayentes de insectos ocurrió cuando se acopló el EAG a un cromatógrafo de gases (CG), funcionando el EAG como un segundo detector, llamado detector antenal. El primer registro de CG-EAD fue reportado por Moorhouse et al. (1969) con el lepidóptero Diparopis castanea. Quienes evaluaron el extracto de la feromona sexual producida por hembras con antena de machos. Sin embargo, y a pesar de que la resolución de los picos cromatográficos no fue buena debido a que en aquellos años la CG utilizaba columnas empacadas, los autores encontraron que las antenas de los machos respondieron consistentemente a tres picos del extracto de las hembras. En este trabajo se sentaron las bases para el desarrollo posterior de la técnica y fue Arn et al. (1975) quienes reportaron un CG-EAD usando una columna capilar en cuyo extremo final se acopló un conector de vidrio en forma de T. Con la ayuda de este dispositivo, una parte de la muestra inyectada y separada pasa directamente al detector de ionización de flama (DIF) del CG usando una línea de transferencia (columna capilar de vidrio sin fase) y la otra parte al EAG (en una relación 1:1). Para evitar problemas de condensación de la fracción de muestra que va en la línea de transferencia al EAG, fue calentada a 200 ºC, y para evitar que la muestra llegue caliente a la preparación antenal, se incorporó un flujo de aire humidificado justo antes de que la muestra llegue a la antena. Con la ayuda del GC-EAD, Arn et al. (1975) confirmaron que el (E, Z)-7,9-acetato de dodecadienilo era un componente importante de la feromona sexual de Lobesia botrana, plaga importante de uvas en los países mediterráneos.

      El sistema de calentamiento para evitar la condensación del efluente está disponible comercialmente (Altech Associates, Supelco, EUA, y Syntech, Alemania). Igualmente existen conectores vendidos por una compañía Australiana (SGE Analytical Science) para separar la muestra que va al DIF y al EAG. El primer tipo de conector (variable outlet Splitter,) es de acero inoxidable y tiene una separación ajustable de 5:1 a 1:1000 a una temperatura de 300 ºC. Este conector tiene la ventaja de incorporar un segundo “make-up” para incrementar el flujo y reducir el volumen muerto (el “make-up” uno se incorpora directamente al DIF). Sin embargo, este conector tiene el inconveniente de ser bastante caro y su mantenimiento se debe hacer cuidadosamente ya que este dispositivo consiste de una pequeña aguja de acero inoxidable que se abre o se cierra, dependiendo de la relación que se quiera tener DIF: EAD. Una alternativa es utilizar un conector (Fixed Outlet Splitter) con una tasa de separación fija de 1:1, 1:5, o 1:10 al detector 1:detector 2. Este separador se coloca dentro del horno del CG, tiene la ventaja de no requerir el segundo “make-up”, ya que funciona solamente con el gas de arrastre, por lo tanto, el análisis de muestras usando este conector es más económico. Este dispositivo consiste en un par de tuercas (una macho y otra hembra), cuyo interior contiene una férula de grafito que tiene en un extremo un pequeño agujero por donde se conecta la parte final de la columna capilar y en el otro extremo de la férula tiene dos agujeros en donde se insertan las líneas de transferencia, una para el DIF y la otra para el EAD.

      La gran ventaja de la CG-EAD es que discrimina selectivamente aquellos picos del extracto que no tienen actividad antenal y sugiere compuestos candidatos a ser evaluados en pruebas comportamentales y de campo. La CG-EAD ha demostrado ser una herramienta invaluable en la identificación de feromonas y atrayentes de insectos de diferentes órdenes. Sin duda alguna que la CG-EAD es la técnica más utilizada en la identificación de semioquímicos comparada con los métodos tradicionales. Por ejemplo, en una revisión de los artículos publicados en el Journal of Chemical Ecology sobre la identificación de feromonas y atrayentes de insectos en los últimos años (2000-2005), de un total de 1167 artículos publicados, se encontró que el 55% reportaron haber utilizado CG-EAD, siendo lepidópteros y coleópteros los más estudiados. En nuestro laboratorio hemos desarrollado la CG-EAD que ha sido de gran utilidad en la identificación de la feromona sexual de Copitarsia decolora (Rojas et al., 2006), la feromona de agregación del picudo del agave, Scyphophorus acupuctatus (Ruiz-Montiel et al., 2008) y en la búsqueda de posibles atrayentes para moscas de la fruta a partir de volátiles aislados de frutos de hospederas (Malo et al., 2005; Cruz-López et al., 2006).

      Después de determinar los picos con actividad antenal, el paso siguiente consiste en la identificación química de esos picos por cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM). Sin embargo, hemos observado que el tiempo de retención de los picos obtenidos por GC-EAD es ligeramente mayor que los de GC-MS, esto debido a que GC-EAD trabaja a alta presión por el flujo de los gases que utiliza, y el CG-EM opera a alto vacío, por lo que no es fácil acoplar ambos equipos. En este sentido, Weisbecker et al. (2004) reportaron el primer equipo CG-EAD-EM, que permite determinar los picos con actividad antenal y simultáneamente identificarlos por CG-EM. Los autores identificaron los compuestos volátiles de la papa que fueron antenalmente activos al escarabajo