Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований. Виктор Сбойчаков
в геометрической прогрессии (рис. 21). Обычно ПЦР включает 20 – 30 циклов, что обеспечивает синтез 1 млн копий искомого фрагмента ДНК.
Рис. 21. Схема полимеразной цепной реакции. Сплошной линией показана исходная ДНК, пунктирной – вновь синтезированная
Для детекции продуктов ПЦР применяется электрофорез в 1,5 – 3 %-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. По окончании электрофореза гель просматривают в УФ-свете на трансиллюминаторе и оценивают результаты.
Метод ПЦР позволяет быстро обнаружить искомый микроорганизм непосредственно в исследуемом материале без выявления чистой культуры, имеет высокую чувствительность (1 × 101– 1 × 103микроорганизмов в 1 г материала). Он широко применяется для обнаружения трудно культивируемых и медленно растущих микроорганизмов (вирусов, хламидий, риккетсий, микоплазм и микобактерий).
В лабораторной практике для индикации и идентификации микроорганизмов используют также метод ДНК-зондов, являющийся разновидностью метода молекулярной гибридизации ДНК-ДНК. Его отличие от последнего заключается в том, что гибридизация ведется не между двумя препаратами тотальной ДНК, а между фрагментами ДНК-зонда (обычно в пределах известного гена) и всей ДНК изучаемого микроорганизма. ДНК-зонды метят изотопами или нерадиоактивной меткой (биотином).
Важное значение в эпидемиологической практике имеют методы внутривидового генетического маркирования штаммов бактерий. К ним относится метод геномной дактилоскопии, или фингерпринтинг (англ. fingerprinting – снятие отпечатков пальцев). Сущность его состоит в рестрикционном анализе ДНК. Очищенную ДНК исследуемого микроорганизма обрабатывают соответствующей специфической эндонуклеазой (рестриктазой), полученные фрагменты ДНК разделяют путем электрофореза в геле. Для каждого исследуемого штамма на электрофореграммах (рестриктограммах) образуется паттерн с характерным набором полос. Число фрагментов, их размер и общая картина расположения специфичны для каждого микроорганизма, как отпечатки пальцев. Сравнивая рестриктограмму контрольного (известного) штамма с рестриктограммой исследуемого штамма, можно определить их тождество или различие. Вариантом метода является риботипирование, когда рестрикции подвергаются участки ДНК, кодирующие рРНК. Метод геномной дактилоскопии позволяет дифференцировать родственные бактерии на внутривидовом уровне.
5.5. Микробиологические основы генной инженерии и биотехнологии
Выдающимся достижением генетики и микробиологии является создание генной инженерии. Генной инженерией называют прикладную генетику, которая разрабатывает методы целенаправленной перестройки геномов и их генетической информации на молекулярном и клеточном уровнях. Она включает в себя совокупность приемов, позволяющих перенести генетический материал из одного организма в другой таким образом, чтобы обеспечить наследование