Métodos analíticos de microbiología general y aplicada. Jorge Luna Fontalvo
de Petri
I. Examen microscópico bacteriano (morfología y tinciones)
Introducción
Los microorganismos se encuentran presentes en una amplia variedad de hábitats y sustratos (vegetales, animales, suelo, agua, etc.). Sin embargo, debido a su pequeño tamaño, no se pueden ver a simple vista; solo es posible observarlos mediante un examen microscópico, el cual se realiza frotando la muestra biológica en una lámina portaobjeto y contrastándola con un colorante. Básicamente, se realizan dos tipos de exámenes microscópicos: el de microorganismos vivos y el de microorganismos muertos (Valenzuela, 2007). En esta práctica de laboratorio nos centraremos en el estudio de microorganismos muertos procedentes de cultivos bacterianos existentes en el laboratorio.
Examen microscópico de microorganismos muertos
Se realiza mediante la observación microscópica de preparaciones fijadas y teñidas, las cuales ofrecen tres ventajas principales para la observación: 1) aumentan el contraste entre la célula bacteriana y el medio que la rodea, 2) permiten distinguir diferentes tipos de células bacterianas según sea su capacidad de teñirse con cualquier colorante (como por ejemplo las tinciones de Gram y Ziehl-Neelsen), y 3) permiten establecer la morfología de la célula bacteriana y de otros microorganismos, su agrupación y también algunas estructuras específicas (Valencia, 2004). Este tipo de preparaciones se basa en los siguientes procedimientos: extensión, fijación y tinción.
•Extensión: consiste en depositar asépticamente, en el centro de un portaobjeto, una gota de agua destilada y, con ayuda del asa de siembra, extraer el inóculo desde un cultivo bacteriano. Luego con el asa estéril se procede a expandir el inóculo junto con la gota de agua sobre la superficie del portaobjeto de manera que quede uniformemente repartida.
•Fijación: después de extendidas, las células bacterianas se deben adherir al portaobjeto en el cual se van a teñir. Para el caso de las bacterias, la fijación por calor es lo más común (método físico a través de la llama del mechero), pero también se recurre a compuestos químicos como formaldehído, ácido fénico, alcoholes, etc. (método químico). En esta práctica utilizaremos el calor para matar las bacterias y adherirlas al portaobjeto.
•Tinción: una vez fijada la muestra, se procede a su tinción, para lo cual se hace uso de colorantes. La mayoría de ellos son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por componentes celulares. Muchos de los colorantes utilizados corresponden a moléculas cargadas positivamente (colorantes catiónicos) como azul de metileno, cristal violeta o safranina, y se combinan con gran afinidad con constituyentes celulares cargados negativamente, tales como ácidos nucleicos y polisacáridos. También existen colorantes aniónicos (moléculas cargadas negativamente), como la eosina, que se combinan con componentes celulares cargados positivamente como proteínas. Un tercer grupo de colorantes está formado por compuestos que se combinan con los materiales lipídicos de las células y son utilizados para localizar depósitos de grasa; por ejemplo, el colorante negro de Sudán (López-Jácome, et ál., 2014).
Existen sustancias químicas denominadas mordientes, que son capaces de combinarse con algún constituyente celular y alterarlo de tal forma que sea más vulnerable a un colorante, de manera que algunos colorantes teñirán mejor solo después de que la célula haya sido tratada con esta sustancia. Los mordientes no son colorantes por sí mismos, y algunos ejemplos de estas sustancias son el ácido fénico y el ácido tánico (Arias y Gómez, 2001).
Mediante las tinciones especiales se pueden determinar morfología, agrupación, flagelos, endosporas, etc. Aun así, es preciso tener en cuenta que todos los métodos de tinción deberán usarse con precaución ya que pueden conducir a errores debido a que las moléculas de colorantes forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones artificiales inducidas por el propio colorante.
Tipos de tinciones
Según el número de colorantes utilizados, las tinciones se pueden agrupar en dos categorías: tinciones simples (en las cuales se emplea un solo colorante) y tinciones compuestas o diferenciales (en las que se emplea más de un colorante).
•Tinción simple: consiste en la aplicación de un solo colorante al extendido previamente fijado, con lo cual se aumenta el contraste de las células para poder observarlas claramente. Uno de los colorantes más indicados es el azul de metileno, que actúa rápida y suavemente sobre todas las células bacterianas y no oscurece los detalles celulares. Además, es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe (Gamazo, et ál., 2005). La tinción simple tiene como objetivo determinar la morfología y agrupación que presentan las bacterias (figura 1).
•Tinciones compuestas o diferenciales: son aquellas en la que se emplea más de un tipo de colorante, por lo que todas las células de la muestra no quedan teñidas iguales. Esto permite poner en evidencia, aparte de la morfología de los microorganismos y su agrupación, algunas estructuras como endosporas, flagelos, depósitos de grasas y la reacción de las bacterias frente a un colorante específico. En esta guía de práctica se realizarán las tinciones diferenciales de Gram, Writz y Ziehl-Neelsen:
•Tinción de Gram: el organelo responsable de la tinción de Gram es la pared celular. La propiedad de teñirse o no de violeta oscuro según la tinción introducida por Christian Gram (1884) es una característica taxonómica importante con la que se correlacionan también otras propiedades de las bacterias. Este procedimiento se inicia con una tinción de las células bacterianas fijadas mediante el colorante básico