Métodos analíticos de microbiología general y aplicada. Jorge Luna Fontalvo
al microscopio, primero con los objetivos de menor aumento (10X, 40X) y busque la zona donde depositó la muestra. Una vez logrado esto, enfoque con el objetivo de inmersión (100X) tal como lo hizo en la tinción simple.
—Termine la observación identificando la morfología, la agrupación y la reacción al Gram de las bacterias observadas y esquematícelas.
—Elimine las preparaciones en la bandeja.
Figura 4. Pasos de la tinción de Gram.
Tinción de Wirtz (figura 5)
—Tome el portaobjeto que contiene el frotis para la tinción de Wirtz. Para este caso se trabajará con el extendido de la bacteria B. cereus.
—Deposite ahora el portaobjeto con su muestra fijada sobre la rejilla.
—Tiña de 6 a 8 minutos con verde de malaquita al 7,6% con calor del mechero y sin dejar secar el colorante.
—Elimine el colorante y lave con agua por 10 a 15 segundos.
—Tiña con una solución al 0,25% de safranina por quince segundos.
—Elimine la safranina y lave con agua.
—Seque con papel absorbente presionando suavemente el portaobjeto y luego expóngalo de forma muy suave a la llama del mechero.
—Observe con el objetivo de inmersión (100X) como de costumbre.
—Identifique las esporas bacterianas de manera libre (exosporas) o en su defecto las endosporas. Esquematice lo observado.
—Terminada la observación, elimine la preparación en la bandeja.
Figura 5. Procedimientos de la tinción de Wirtz.
Tinción de Ziehl-Neelsen (figura 6)
—Tome el portaobjeto que contiene el frotis para la tinción de Zielh-Neelsen. Para este caso se trabajará con el extendido de la bacteria M. tuberculosis.
—Deposite ahora el portaobjeto con su muestra fijada sobre la rejilla.
—Cubra la preparación con fucsina fenicada y deje actuar por cinco minutos con calor del mechero hasta desprender vapores, pero sin dejar secar el colorante.
—Elimine el colorante y lave con agua de 10 a 15 segundos.
—Decolore con alcohol ácido durante 10-20 segundos.
—Elimine el alcohol ácido y lave con agua.
—Tiña con azul de metileno como colorante de contraste durante 2 minutos.
—Elimine el colorante y lave con agua de 10 a 15 segundos.
—Seque con papel absorbente presionando suavemente el portaobjeto y luego expóngalo de forma muy suave a la llama del mechero.
—Observe con el objetivo de inmersión (100X) como de costumbre.
—Identifique las células bacterianas AAR teñidas de color fucsia y esquematícelas.
—Terminada la observación, elimine su preparación en la bandeja.
Figura 6. Pasos de la tinción de Zielh-Neelsen.
Complete las siguientes tablas de acuerdo con las tinciones realizadas:
Preguntas complementarias
1.¿Cuáles son los dos propósitos de la fijación por calor?
A.
B.
2.¿Por qué los colorantes básicos son más apropiados para teñir bacterias que los colorantes ácidos?
3.¿Cuál es el fundamento de la tinción de Gram?
4.¿Qué son bacterias Gram variables? Cite tres ejemplos.
II. Medios de cultivos
Introducción
En la naturaleza los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas muy variadas y diferentes. La Microbiología se ha podido desarrollar debido a la posibilidad de estudiar especies aisladas de microorganismos, gracias a la aplicación de los medios de cultivos.
Existen y se utilizan una gran variedad de medios de cultivos cuya composición varía de acuerdo con las necesidades nutricionales de los organismos que se pretende estudiar. Así, el trabajo de aislamiento en cultivo puro de una especie dada puede facilitarse con ayuda de medios de cultivos que aprovechan alguna característica particular para sus exigencias nutricionales, aparte de considerar otros requerimientos como la temperatura, el oxígeno, el pH, etc. (Gómez y Batista, 2006).
Los medios de cultivos se definen como cualquier preparado, sólido o líquido, que contiene todas las sustancias nutritivas para el desarrollo de los microorganismos. Este debe ser estéril, tener un pH adecuado y estar protegido de la contaminación ambiental (Valenzuela, 2007).
En general, todo medio de cultivo debe contener los siguientes grupos de nutrientes:
•Fuente de hidrógeno: constituye la fuente de energía. Generalmente, es un azúcar que funciona a la vez como carbono.
•Aceptores de hidrógeno: son indispensables para aquellos microorganismos que no ocupan el oxígeno en la respiración y para aquellos microorganismos fermentadores que no utilizan sus propios metabolitos como aceptor de hidrógenos.
•Fuente de carbono: todos los microorganismos necesitan una fuente de carbono; algunos utilizan el CO2 del aire (autótrofos), pero la mayoría de las bacterias utiliza compuestos orgánicos carbonados preformados (organótrofos).
•Fuente de nitrógeno: es esencial para todos los organismos. Algunos lo requieren como compuesto orgánico, y otros pueden utilizar compuestos inorgánicos. Un pequeño grupo puede utilizar el nitrógeno atmosférico; por ejemplo, Azotobacter.
•Sales minerales: aportan elementos tales como azufre, fósforo y algunos activadores enzimáticos presentes en las coenzimas de los citocromos y en las peroxidasas (oligoelementos: Ca2+, Mg2+, Fe2+, Co2+, Mn2+, Cu2+, etc.). Todos los microorganismos necesitan aporte de sales minerales para su desarrollo.
•Factores de crecimientos: un factor de crecimiento es un compuesto orgánico (aminoácidos y bases nitrogenadas) que una célula debe tener para su crecimiento pero que ella misma no es capaz de sintetizar.
Clasificación de los medios de cultivos
Los medios de cultivos se han clasificado en forma artificial de acuerdo con su estado físico, composición química y utilización, solo para fines de ordenamientos.
Según su estado físico, los medios se clasifican en:
•Medios líquidos: comúnmente llamados caldos. Se emplean para la homogenización de muestras, realizar diluciones y enriquecimiento del medio de cultivo. Así mismo, son útiles para la activación de cepas microbianas liofilizadas. Por lo general, estos medios suelen servirse en tubos de ensayos o en matraces cuando se requiere analizar grandes cantidades de muestras (figura 7). Ejemplos: caldo peptona, caldo infusión cerebro corazón, caldo lactosado, caldo brila, etcétera.
Figura