Métodos analíticos de microbiología general y aplicada. Jorge Luna Fontalvo
se tratan después con alcohol acetona, de modo que las células Gram positivas retienen el complejo colorante-yodo y quedan azules, y las células Gram negativas son decoloradas por el alcohol acetona. Estas últimas se hacen visibles mediante una coloración de contraste con otro colorante como la fucsina o safranina (Schlegel, 1997). La tinción de Gram tiene como objetivo identificar la morfología de las células bacterianas, su agrupación y la reacción al Gram (Gram positiva o Gram negativa).
•Tinción de Wirtz: esta tinción permite colocar en evidencia las endosporas bacterianas, cuyos constituyentes químicos son capaces de retener fuertemente el colorante verde de malaquita al 7,6%, adquiriendo el color de éste, mientras que el resto de la célula bacteriana se tiñe del color del colorante de contraste utilizado. La tinción de Wirtz tiene como objetivo determinar la presencia de las endosporas, aparte de observar la morfología de la célula y su agrupación.
•Tinción de Ziehl-Neelsen (ZN): esta tinción fue instituida por el bacteriólogo Franz Ziehl y el patólogo Friedrich Neelsen. Principalmente se emplea para aquellas bacterias difíciles de teñir como las del género Mycobacterium también conocidas como bacterias ácido-alcohol resistentes (AAR). En esencia son bacterias Gram positivas, pero no retienen el colorante cristal violeta debido a que tienen una pared muy gruesa hidrofóbica, cerosa y rica en ácidos micólicos, lo cual les confiere resistencia a muchos colorantes. La tinción utiliza el colorante fucsina fenicada (colorante primario), el cual debe aplicarse en condiciones de calor, pero sin dejar secarlo con el fin de que penetre la pared celular de las bacterias. Posteriormente, se aplica una mezcla de ácido y alcohol (decolorante), y por último, el colorante de contraste (azul de metileno). Las células ácido-alcohol resistentes permanecen teñidas de fucsia ya que retienen el primer colorante, mientras que las no resistentes se decoloran con el ácido-alcohol y se teñirán de azul con el colorante de contraste (Gamazo, et ál., 2005). La tinción NZ tiene como objetivo determinar la resistencia al alcohol ácido, aparte de la morfología y agrupación de las células bacterianas.
Figura 1. Morfología y agrupación de las células bacterianas.
Objetivo
El estudiante deberá, a partir de cada una de las tinciones que realice, determinar la morfología de las células bacterianas y su agrupación y observar endosporas. Así mismo estará en capacidad de identificar la reacción a la tinción de Gram y Ziehl-Neelsen.
Materiales
•Cultivo de Escherichia coli.
•Cultivo de Klebsiella pneumoniae.
•Cultivo de Staphylococcus aureus.
•Cultivo de Bacillus cereus.
•Cultivo de Mycobacterium sp.
•Láminas portaobjetos.
•Asas de siembra.
•Solución de azul de metileno.
•Solución de violeta de genciana.
•Solución cristal violeta.
•Lugol.
•Alcohol acetona.
•Solución de fucsina.
•Solución de safranina al 0,25%.
•Solución de verde de malaquita al 7,6%.
•Solución de fucsina fenicada.
•Ácido-alcohol.
•Rejillas para tinción.
•Bandejas.
•Frascos lavadores con agua.
•Toallas de papel absorbente.
•Aceite de inmersión.
•Microscopios.
•Mecheros.
•Fósforos.
Procedimiento
Preparación del frotis bacteriano (figura 2)
—Tome varios portaobjetos y, con ayuda de un marcador permanente de punta fina, trace pequeños espacios, los cuales serán utilizados para el rotulado de las preparaciones microscópicas.
—Deposite 1 ó 2 gotas de agua destilada en los espacios delimitados para los extendidos de los inóculos.
—Con ayuda del asa de siembra, previamente esterilizada en la llama del mechero, extraiga asépticamente una porción de la colonia bacteriana que se encuentra en los cultivos (S. aureus, E. coli, B. cereus, Mycobacterium tuberculosis) y deposítela en el centro del portaobjeto junto con las gotas de agua destilada.
—Extienda la porción de la colonia con la gota de agua en el portaobjeto utilizando el asa de siembra. Realice círculos sucesivos en el portaobjeto hasta cubrir todo el espacio delimitado para el extendido.
—Fije el extendido. Para esto deberá pasarlo por la llama del mechero levemente.
—Realice todos los frotis bacterianos para las diferentes tinciones.
Figura 2. Procedimientos para la obtención de un frotis bacteriano.
Tinción simple (figura 3)
—Tome los portaobjetos que contienen los frotis destinados para la tinción simple. Para este caso se recomienda trabajar con los frotis de las bacterias S. aureus y B. cereus.
—Deposite ahora los portaobjetos en la rejilla y proceda a teñirlos agregando sobre las muestras el colorante azul de metileno o violeta de genciana. Déjelos actuar por un minuto.
—Elimine el colorante y lave con agua. Seque con papel absorbente presionando suavemente los portaobjetos y luego exponiéndolos suavemente a la llama del mechero.
—Observe las preparaciones al microscopio, primero con los objetivos de menor aumento (10X, 40X), agregue una gota de aceite de inmersión y enfoque con el objetivo de inmersión (100X).
—Identifique la morfología y agrupación de las bacterias observadas y esquematícelas.
—Terminada la observación, elimine las preparaciones en la bandeja.
Figura 3. Procedimientos básicos para la tinción simple.
Tinción de Gram (figura 4)
—Tome los portaobjetos que contienen los frotis destinados para la tinción de Gram. Para este caso se recomienda trabajar con los frotis de las bacterias E. coli, S. aureus y B. cereus.
—Deposite ahora los portaobjetos con su muestra fijada sobre la rejilla.
—Tiña con cristal violeta durante un minuto.
—Elimine el colorante y lave suavemente con agua.
—Aplique lugol (mordiente) durante un minuto.
—Elimine el lugol y lave con agua.
—Decolore con una solución de alcohol-acetona durante 10-30 segundos (el tiempo dependerá del grosor del frotis).
—Elimine el alcohol-acetona y lave con agua.
—Tiña con fucsina o safranina (contraste) por un minuto.
—Elimine el colorante de contraste y lave con agua.
—Seque con papel absorbente presionando