Choroby zakaźne i pasożytnicze. Отсутствует
G.R., Ellepola K., Seneviratne C.J., Koga-Ito C.Y.: Potential use of phenolic acids as anti-Candida agents: A review. Front. Microbiol., 2015, 6: 1420.
20. Voltan A.R., Quindós G., Alarcón K.P. i wsp.: Fungal diseases: could nanostructured drug delivery systems be a novel paradigm for therapy? Int. J. Nanomedicine, 2016, 11: 3715–3730.
21. Xu S.-X., Shen J.-L., Tang X.-F., Feng B., Xu H.-Q.: Newer antifungal agents micafungin and voriconazole for fungal infection prevention during hematopoietic cell transplantation: a meta-analysis. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci., 2016, 20: 381–390.
7
Metody diagnostyczne i ich znaczenie w rozpoznawaniu chorób zakaźnych
Miłosz Parczewski
Diagnostyka chorób zakaźnych opiera się na założeniu wykrycia, metodami bezpośrednimi lub pośrednimi, czynników zakaźnych w materiale biologicznym. Kolejnym etapem może być określenie lekowrażliwości analizowanych drobnoustrojów, na podstawie zarówno tradycyjnych metod fenotypowych z określeniem minimalnego stężenia hamującego leku (antybiotyku) na podłożach stałych lub płynnych (czasochłonne), jak i pośrednich metod molekularnych wykrywających warianty genetyczne związane z opornością na antybiotyki, preparaty przeciwgrzybicze czy przeciwwirusowe. Bieżąca diagnostyka w chorobach zakaźnych w dużej mierze opiera się na wykryciu sygnału odpowiadającego obecności patogenu lub jego fragmentu (np. unikalnej struktury DNA czy RNA, włączając sekwencje kodujące rybosomy, białek strukturalnych, komponentów antygenowych, enzymów, toksyn czy innych białek).
7.1. Diagnostyka mikroskopowa
Diagnostyka mikroskopowa może być przeprowadzona szybko, ale jej dokładność zależy od doświadczenia personelu i dostępu do sprzętu wysokiej jakości. Mikroskopowo można przykładowo odróżnić powierzchniową kolonizację od zakażenia inwazyjnego. W niebarwionych, wilgotnych preparatach można wykryć inwazje grzybicze (często konieczne jest wytrawienie tkanek 10% chlorkiem potasu), pasożyty (szczególnie jaja i larwy), wiciowce (rzęsistek pochwowy) i krętki (charakterystyczna rotacja wzdłuż długiej osi – badanie w tzw. ciemnym polu pozwala wykryć zakażenie Treponema pallidum). Próbki często są zagęszczane (wirowane) przed badaniem. Badanie tzw. „żywej kropli krwi” jest testem, który nie ma wartości diagnostycznej ani klinicznej i nie jest polecane przez organizacje certyfikujące testy medyczne.
Barwienie metodą Grama pozwala na identyfikację różnic w budowie ścian komórkowych na podstawienie zatrzymywania barwnika fioletowego, klasyfikację bakterii na Gram-dodatnie (ciemnoniebieskie) i Gram-ujemne (czerwone) oraz określenie morfologii i rozkładu patogenów (pałeczki, ziarniaki, dwoinki itd.). Barwienie to umożliwia również wykrycie obecności komórek epitelialnych lub granulocytów i jest używane do oceny plwociny, wymazów z pochwy, płynu stawowego, mózgowo-rdzeniowego, otrzewnowego czy opłucnowego. Barwienie Ziehla-Nieelsena służy do identyfikacji tzw. mikroorganizmów kwasoopornych (Mycobacterium spp., różnicowanie Nocardia spp. z Actinomyces, wykrywanie Rhodococcus oraz oocyst Cryptosporidum i Isospora). Barwienie fluorochromami, np. oranżem akrydyny, było stosowane do wykrywania anaplazmozy, bartonelozy, trypanosomoz, Plasmodium spp. czy Babesia spp. Aktualnie wykorzystuje się je rzadko. Tusz indyjski służy do wykrywania grzybów otoczkowych (Cryptococcus spp.), barwienia srebrem (na przykład metodą Warthina-Starry’ego) krętków, Helicobacter pylori, Microsporidium spp. czy Bartonella spp. Barwienie Giemsy jest głównie używane do wykrywania zarodźców malarii i innych pasożytów krwi, a także Histoplasma capsulatum, Chlamydia spp., Trichomonas vaginalis i Pneumocystis jirovecii, a także niektórych patogenów wewnątrzkomórkowych. Barwienie Gomoriego-Wheatleya jest stosowane w mikrosporydiozie.
7.2. Badania mikrobiologiczne
7.2.1. Posiewy
W celu właściwej identyfikacji mikroorganizmów za pomocą posiewu konieczne jest zastosowanie odpowiedniego sztucznego medium stałego lub płynnego. Podłoża płynne są używane do materiałów, w których podejrzewa się niewielkie stężenie patogenu (krew, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyny dializacyjne, płyn otrzewnowy). Podłoża płynne mogą być przesiane na podłoża stałe po wykryciu wzrostu bakterii. Aktualnie do niektórych posiewów, w tym do posiewów krwi, najczęściej stosuje się systemy automatyczne wykrywające dwutlenek węgla z oceną ciśnienia gazu, zmętnienia próbki lub hemolizy, sygnalizujące obecność drobnoustrojów, co pozwala na szybką identyfikację i przesianie próbek dodatnich. Systemy automatyczne są również stosowane dla hodowli Mycobacterium spp. przy zastosowaniu odpowiednich podłoży płynnych. Użycie podłoży płynnych może pozwolić na wykrycie wzrostu Mycobacterium tuberculosis w ciągu około 2 tygodni (> 4 tygodni dla podłoża Lowensteina), choć próbki powinny być hodowane co najmniej 8 tygodni.
W praktyce najczęściej stosuje się podłoża uniwersalne, pozwalające na wykrywanie szerokiego wachlarza klinicznie istotnych patogenów, również takich, które produkują małe ilości dwutlenku węgla (np. Acinetobacter spp.).
Posiewy krwi pobiera się w momencie narastania temperatury ciała, optymalnie przed szczytem gorączki, w parach umożliwiających zarówno hodowle tlenowe, jak i beztlenowe. Pobranie 3 zestawów posiewów krwi pozwala na czułość detekcji bakteriemii na poziomie 93,9% a 4 około 99%. U osób w stanie ogólnym ciężkim posiewy krwi należy pobrać bezpośrednio po sobie z 2 osobnych wkłuć, z następowym podaniem antybiotyku i powtórzeniami posiewu po 24 i ewentualnie 48 godzinach. Materiały z posiewem powinny być dostarczone do laboratorium mikrobiologicznego najszybciej jak to możliwe, a do czasu dostarczenia powinny być przechowywane w temperaturze pokojowej. Należy unikać przechłodzenia próbek w czasie transportu.
Systemy automatyczne pozwalają na szybką identyfikację bakterii na podstawie ich fenotypu – izolaty są hodowane na różnych substratach. Wykorzystuje się też komercyjne testy enzymatyczne, których wyniki porównuje się ze standardami odpowiadającymi danej bakterii. Do identyfikacji produktów bakteryjnej przemiany materii, stanowiących swoisty „odcisk palca” danego patogenu można również stosować chromatografię gazową lub cieczową. Chromatografia pozwala także na identyfikację długołańcuchowych kwasów tłuszczowych ścian i błon komórkowych oraz grzybów, co przekłada się na dokładną identyfikację gatunkową.
7.2.2. Oznaczenie lekowrażliwości na antybiotyki
Testy lekowrażliwości (antybiogram) są modelami in vitro i nie uwzględniają wieloczynnikowej dynamiki zakażenia in vivo (farmakodynamika i farmakokinetyka, zmiany stężeń leków w poszczególnych tkankach, charakterystyka immunologiczna gospodarza). Badania lekowrażliwości mogą być ilościowe lub jakościowe. Metody jakościowe pozwalają na określenie trzech kategorii lekowrażliwości:
• wrażliwe (S – susceptible);
• średniowrażliwe (I – intermediate);
• oporne (R – resistant).
Do określania lekowrażliwości najczęściej stosowana jest metoda dyfuzyjno-krążkowa, w której na podłoże hodowlane nakłada się krążki nasycone antybiotykiem z oceną średnicy strefy zahamowania wzrostu mikroorganizmów. Antybiotyki są dobierane do gatunku bakterii. Średnica strefy zahamowania wzrostu jest przekładana na kategorię lekowrażliwości zgodnie z wytycznymi dla danego patogenu. Metody ilościowe lub półilościowe określają minimalne stężenia hamujące wzrost danego patogenu (MIC), które pozwala na podanie wartości numerycznej i jej przełożenie na kategorię lekowrażliwości. W celu oszacowania MIC można stosować metody rozcieńczeniowe (inkubacja w seryjnych rozcieńczeniach antybiotyku na podłożach stałych lub płynnych